PCR技术的基本操作和应用

　　聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶***案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973 年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

　　PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

　　一、实验目的

　　1.掌握聚合酶链式反应的原理。

　　2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

　　二、实验原理

　　PCR技术，即聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年(1993年获诺贝尔化学奖)建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA***与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

　　PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

　　PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备;

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

　　重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　三、实验试剂与器材

　　模板DNA、2.5mmol/L dNTP

　　Taq DNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

　　10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

　　PCR仪、移液枪、PCR板

　　四、实验步骤

　　1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：

　　模板DNA 2μL

　　引物1 1μL

　　引物2 1μL

　　dNTP 1.5μL

　　MgCl2 2μL

　　10×buffer 2μL

　　ddH2O 10μL

　　Taq酶 0.5μL

　　2、设置PCR反应程序。

　　3、上样，启动反应程序。

　　4、扩增产物的电泳检测。

　　1、生命科学 a、人类基因组计划 随着的PCR日臻完善，科学家于2003年在完成的人类基因组“工作框架图”的基础上，经过整理、分类和排列后得到的更加准确、清晰、完整的基因组图谱。这是对人类基因组基本面貌的首次揭示，表明科学家们开始部分“读”出人类生命“天书”所蕴涵的内容。 b、后基因组计划 人类基因组DNA序列图谱完成后，鉴定基因组多态性及其单倍型以及寻找其在生物和医学应用中重要成为人们关心的热点。以研究基因功能为核心的“后基因组时代”已经来临，大规模的结构基因组、蛋白质组以及药物基因组的研究计划已经成为新的热点。 c、物种的分类、进化及亲缘关系 可以进行物种进化的保守性分析及物种多态性分析、物种鉴定。

　　2、医药 a、疾病的诊断和治疗 遗传性疾病：如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏等有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，均可预测;癌基因的检测和诊断：检测恶性肿瘤的标记物来诊断癌症等疾病;利用基因治疗方法治疗肿瘤性疾病。 b、致病病原体的检测 检测范围包括细菌、病毒(SARS及禽流感病毒H5N1等)、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒(乙肝)，细菌(如结核、厌氧菌)和原虫(如梅毒螺旋体)等来说尤为适用。 c、DNA指纹、个体识别(DNA身份证)、亲子关系鉴别和法医物证 可以用一根头发、一个细胞、一个精子来完成上述工作，这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型。 d、生物工程制药 许多药物可通过工程菌和细胞来大量生产，如干扰素、白介素、促红细胞生长素等药物。 e、转基因动物制药及疾病模型 转基因动物与医学及生物医药研究的关系越来越密切。近年来,各种人类疾病转基因动物模型不断建立。如转基因动物在遗传病、心血管疾病、肿瘤、高血压病、病毒性疾病、异种移植、输血医学、药理学研究中的应用;利用转基因动物-乳腺生物反应器生产药物蛋白,好比在动物身上建“药厂”,可以从动物乳汁中源源不断地获得具有稳定生物活性的基因产品。这是一种全新的药物生产模式,具有投资成本低,药物研制周期短和经济效益高等优点。

　　3、农业科学 a、转基因植物 按其功能主要分提高产量、抗病力、抗除草剂、改良品质和发育调节。如:大豆、玉米、马铃薯、番茄等。 b、转基因动物 在农业方面，主要在改良畜禽生产性状,提高畜禽抗病力及利用转基因畜禽生产非常规畜产品。

　　4、考古学及历史事件解读利用人类短串联重复STR-PCR技术，研究人类种族的遗传多态性，效果非常稳定。目前此技术已广泛用于生物考古、种系发育、民族学、人类学和考古学等各个领域中。

　　5、卫生安全 a、食品微生物的检测 传统的致病菌检测首先经过长时间的培养，费时费力，应用PCR技术则非常迅速、准确。主要用于：食品致病菌的检测，如肉毒唆菌等;乳酸菌的检测;水中细菌指标测定。 b、转基因食品的检测 目前世界转基因食品已经有100多物种，大多数已经用于食品。转基因食品对人体健康的危害及对生态的影响也日受世界广泛的重视，因此对转基因食品的检测成为控制其泛滥的一种手段。 c、动、植物检疫　灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物(种畜、种籽)等是否携带烈性传染病(艾滋、动物病毒、植物病毒等)病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。