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题目

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就是想做个梯度稀释的cDNA的标准曲线,请问我应该怎么做,我用的是Roche的荧光定量PCR仪,请问我是选相对定量还是绝对定量做曲线啊?

答案

博凌科为-为你相对定量还是绝对定量,这要看你的实验目的,如果你只关心某一基因的相对表达量,举例来说,如桃果实,当你采收后,很易变软,那我现用一种药剂处理一下,使它变软的速度慢一些或不变软,这就出现了对照和处理,如果你只想知道桃果实软化相关的某一基因在处理后的表达较对照降低或增加了几倍,那只需做相对定量就可以了.至于绝对定量而言,也举个例子吧,医生对一个病人的每毫升血液中有到底有多少病毒颗粒感兴趣,这是就要做绝对定量了.绝对定量中必须要用到标准曲线,且其标准品浓度已知,并要求相当精确.相对定量也可以用标准曲线,其目的是计算扩增效率,也可以不用,通过扩增曲线求扩增效率.你要是想做梯度稀释的cDNA样品的标准曲线,这个容易,但我建议你买个EasyDilution,Takara有卖,这个有助于你在稀释样品时不会因粘在枪头上而带来过多的误差.操作如下：1、准备直接反转录的cDNA样品8ul；2、转移到另一新离心管中再加8ulEasyDilution,混均；3、从2中再取8ul放到另一管中,再加8ulEasyDilution,混均；4、重复步骤3,共有5个点就可以了.上述是按2倍的梯度来稀释的,这要看你研究的基因表达丰度,若很高你也可按10倍的梯度来做.不知我的解释是否能让你明白.