western blot中,封闭液封闭完成后,需要用PBS或PBST洗涤滤膜,然后进行一抗孵育,在一抗孵育完成后为什么要清洗滤膜上的磷酸盐,磷酸盐对后续的加入二抗有什么影响?

题目

western blot中,封闭液封闭完成后,需要用PBS或PBST洗涤滤膜,然后进行一抗孵育,在一抗孵育完成后为什么要清洗滤膜上的磷酸盐,磷酸盐对后续的加入二抗有什么影响?
一抗孵育完成后，我是知道洗膜的，可是《分子克隆》上说要清洗掉磷酸盐与叠氮钠，清洗叠氮钠我知道为什么，可是不知道为什么要清洗掉磷酸盐，因为在网上有不少资料在洗膜过程中是不用换掉PBS的（因PBS中含有磷酸盐），可是《分子克隆》上说要在一抗孵育完成后用TBST洗滤膜，

答案

一抗孵育完成后洗膜是为了洗掉未和膜结合的抗体,而不是磷酸盐.只有洗干净非特异性结合在膜上的一抗,加二抗时才不会因非特异结合而呈现很重的背景.至于是使用PBS(T)还是TBS(T),这要具体看你的二抗种类.PBS不适合AP系列,PBS/TBSS适合AP和HRP体系.另外,做磷酸化蛋白的WB,PBS不合适.