培养细胞如何提取mRNA,如何逆转录?

题目

培养细胞如何提取mRNA,如何逆转录?
培养细胞提取mRNA的原理是什么？如何用所提取的mRNA进行逆转录？

答案

1 细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠,细胞脱壁）.
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15秒.
3）、室温静置2-3分钟后,12000 rpm,15 min,4℃,离心.然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过）,加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟.
4）、12000 rpm,10分钟,4℃,离心.观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清（小心别丢了沉淀）,75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后,7500 rpm,5 min,4℃离心.
5）、去上清,点离,用小Tip吸干液体.气干沉淀5-10分钟,DEPC处理水20-30 ul加入,中枪打匀,55-60℃水浴10分钟溶解总RNA,测OD值.
6）、电泳.
2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022,QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 ul.
2）、加入Buffer OBB 250 ul,Oligotex Suspension 15 ul.用Tip打匀或用手弹匀.
3）、70℃水浴,3分钟（裂解RNA的二级结构）.
4）、20-30℃条件下,静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）.
5）、高速离心2分钟,小心吸走上清（该上清要保留）,留下约50 ul的上清在原管里.
6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1分钟.
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速离心1分钟,丢掉滤过液.
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4次,高速离心1分钟.
9）、为保证最大的 mRNA产量,可再次重复第8步.
10）、电泳.
RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低!其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出.
逆转录过程请看参考资料.