血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳实验为什么样品在浓缩胶中被压缩成薄层

题目

血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳实验为什么样品在浓缩胶中被压缩成薄层

答案

浓缩胶的作用原理
不连续缓冲系统的主要优点之一是可以使用稀样品.这是因为在样品进入分离胶以前,先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被 浓缩至一极窄的区带.其作用原理是在缓冲系统中的弱酸,如甘氨酸,在接近其pKa的pH值时,任何时候都只有一部分分子带负电.如样品和浓缩胶均用pH 6.7的Tris-HCI缓冲液,电极液用Tris-甘氨酸缓冲液.此时,甘氨酸很少解离,其有效泳动率很低,而氯离子却有很高的泳动率,蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间.一旦加上电压,作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来,并在其后面留下一个导电性较低的区带.由于导电性与电场强度成反比,这一区带便获得较高的电压梯度,并加速甘氨酸的泳动,使其赶上氯离子, 建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态,使这些带电颗粒以相同速度泳动,两种离子之间具有明显的边界.当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时,在移动界面前有一低电压梯度,在界面后有一高电压梯度.由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低,因此氯离子能迅速越过.移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中,其泳动速度比甘氨酸快.因此,移动的界面将蛋白质分子堆积到一起,浓缩为一狭窄的区带.蛋白质在移动界面中的浓缩作用仅取决于样品和浓缩胶中的Tris-HCI的浓度,而与样品中蛋白质的最初浓度无关.由于浓缩胶为大孔凝胶,故对样品没有分子筛作用.当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时,凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离.此时甘氨酸的有效泳动率增加,使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动.同时由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小.于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动,并根据其固有的带电性和分子大小进行分离.