本人看了很多论坛和资料,大多的elisa都是测未知抗原和抗体,因为我是从植物内混合蛋白质中测出目的蛋白的浓度,我们目前有需检测蛋白的相关抗原、自己免疫的多克隆的一抗和HRP-标记的二抗,是不是我们包被

题目

本人看了很多论坛和资料,大多的elisa都是测未知抗原和抗体,因为我是从植物内混合蛋白质中测出目的蛋白的浓度,我们目前有需检测蛋白的相关抗原、自己免疫的多克隆的一抗和HRP-标记的二抗,是不是我们包被的时候用包被液倍比稀释抗原,并将需检测的蛋白也按照设定的1:20、1:40、1:80、1:160稀释后一起包被过夜?
我在想我是不是可以认定我们有的这个抗原则为我们的标准品,然后来检测我们的蛋白.不甚感激~
我们目前的设计流程是：
1.包被抗原和待测蛋白 4℃过夜
（抗原按照倍比稀释加入包被液为:10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.15625,0 单位是μg/ml 蛋白1:100稀释都加入)
2.第二天弃液,PBST洗板3次,拍干
3.每孔加入3％BSA封闭至满孔,37℃湿盒湿育 2h
4.洗版,
5.每孔加入稀释好的一抗（1:80）100μl,37℃湿盒湿育 2h
6.洗版,
7.每孔加入辣根酶标记的IgG(1:1000)100ul,37℃湿盒湿育 1h
8.
9.每孔加入100ul底物反应液（现用现配）暗反应15min
10.加入50μl 2MH2SO4 停止反应上机在450nm下测标曲并读值.
目前的问题是：如何能确定我们蛋白的最佳稀释浓度,和一二抗的最佳工作浓度?

答案

具体做法要看你的实验设计,是要做夹心ELISA还是间接ELISA. 看你的描述应该是夹心法: 包被单抗到孔板上,然后加抗原标准品和未知样品孵育, 然后加HRP标记的二抗,最后TMB显色.
所以你第一步应该是包被液稀释你的一抗,过夜包被,第二天BSA做封闭, 然后测样品.
建议楼主动手前先了解一下基本的ELISA技术知识.
请用google搜索引号内的内容: "Technical Guide for ELISA filetype:pdf"
补充: 你这种方式是直接ELISA,也是最不靠谱的一种方法. 如果你们坚持这样做的话...
1. 标准品和样品的最佳稀释度,这个得做实地测试,看看待测蛋白的信号是个什么水平,再做调整
2. 一二抗的稀释度, 你需要做一个滴定, 比如,给定一定量的标准品,测试1:1000 到1:10000 的一抗和二抗组合,看看那个组合信号高, 同时背景低.