已知一个基因的mRNA和cDNA,我想克隆此基因,进行转染表达,但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求!

题目

已知一个基因的mRNA和cDNA,我想克隆此基因,进行转染表达,但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求!
我目的片段大小为2800,载体为eGFP-N1,设计引物中,我是取了ATG开始的前20个左右的碱基,加入酶切位点和保护碱基,后面是取了去掉终止密码子的互补序列,加入酶切位点和保护碱基……（问题：1、除了酶切位点和保护碱基,还有什么需加入什么吗?2、需要在上游序列中加入KOZAK序列吗?其作用是什么?下游也需要吗?3、酶切位点的保护碱基是特定的吗?4、克隆目的基因,必须从ATG开始设计上游引物,终止密码子设计下游引物吗?可不可以从中间或者两侧设计?因为位置若固定的话很难找到合适的引物）……十分紧急,

答案

1.首先这应该是个融合表达载体.应该考虑后面的读码框问题.就是应该适当在后面的酶切位点前加入0-2个碱基.使得你的目的基因和egfp在同一读码框内.
2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用,这就看你后期的实验目的了.不过不加的话应该只是效果没有加了好,而不是没有效果.下游当然不用加.
3.NEB公司的网站上有特定酶的保护碱基图表.他们应该都是进行过研讨的,所以建议您参考这个.
4.克隆目的基因当然要保证从ATG开始.到终止码结束.这样叫一个完整的CDS区,表达一个完整的功能蛋白.不可以小于这个范围,但是多出来也许可以吧.就是从两侧的UTR区开始设计.但是我不敢保证啊.所以我建议您先在UTR区设计引物,扩出来长片段后再扩增您的目的片段.这样会容易点.
P.S.保护碱基的作用是可以使PCR产物两端的酶切位点被识别,从而可以直接酶切PCR产物使其产生粘性末端,以便进行后续的克隆.这和PCR能否扩增出来没有任何关系.